白藜芦醇——一种可有效抗肺纤维化的化合物

　　上海市控江中学 赵欣怡

　　指导教师 王久存

　　来源：全国青少年科技创新大赛获奖作品展播

　　肺纤维化是一种严重的间质性肺部疾病，目前主要采用抗炎药物和免疫抑制剂、抗纤维化药物、抗凝血药物、肺移植等措施进行治疗，但临床试验表明，上述药物治疗效果大多不理想，不良反应多，易引发耐受性。迄今为止，肺纤维化的治疗仍是一项国际难题，世界卫生组织将其列为肺系难治性疾病之一。因此，寻找有效治疗肺纤维化的药物就成为生物医药领域的重要课题。

　　白藜芦醇（芪三酚；3，4'，5- 三羟基芪，英文resveratrol）是多酚类化合物，主要来源于花生、葡萄、桑葚等植物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及延缓衰老等功能。有研究显示，白藜芦醇可干预博莱霉素致大鼠肺纤维化，且中高剂量的白藜芦醇作用等同于地塞米松。但白藜芦醇干预肺纤维化机制的研究尚处于起步阶段，没有充足的实验数据可以证明白藜芦醇能够阻止肺纤维化的形成，对于其具体作用机制的阐述更是空白。有研究表明上皮间质转化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）在肺纤维化的发生发展中发挥了重要作用。因此，我们猜想白藜芦醇是否通过干预EMT 进程来抑制间质细胞的增殖活化，从而阻止肺纤维化的形成。

　　基于实验室前期研究中白藜芦醇可干预大鼠肺纤维化进程这一现象，我们选定EMT 这一病理过程为研究对象，利用促纤维化因子Transforming Growth Factor β1（TGF-β1）处理肺癌上皮细胞株A549 以诱导细胞EMT 反应，探究白藜芦醇对肺上皮细胞间质转化的影响及机制。我们将通过实验，从白藜芦醇对小鼠肺纤维化的阻止效果、抑制EMT细胞形态变化效果、对EMT相关基因及蛋白表达的影响、EMT过程中白藜芦醇对TGF-β1信号通路的影响等四个方面来验证我们的猜想——白藜芦醇对肺纤维化的形成有一定的阻止作用。

　　1. 对小鼠肺纤维化的阻止效果

　　我们利用博莱霉素建立的肺纤维化小鼠研究白藜芦醇对肺纤维化可能的干预机制。相对于博莱霉素组，病理组织检测上，白藜芦醇可抑制肌成纤维细胞的分化，并减少胶原的沉积。

　　2. 抑制EMT细胞形态变化

　　用10ng/ml TGF-β1 联合5ng/ml TNF-α 处理A549 细胞48h 后，显微镜下观察细胞形态变化，结果显示TGF-β1 联合TNF-α 显著诱导A549 细胞由上皮细胞的鹅卵石状转化为间质细胞的长梭状。同样地，在TGF-β1 联合TNF-α 处理基础上给予20μM 白藜芦醇处理A549 细胞，48h 后镜检结果显示白藜芦醇处理显著抑制TGF-β1 联合TNF-α 诱导的上皮细胞间质样细胞形态变化。

　　3. 对EMT相关基因及蛋白表达的影响

　　应用实时荧光PCR 检测白藜芦醇及TGF-β1 处理前后肌成纤维细胞细胞标志物α- 平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、成纤维细胞标志物波形蛋白（Vimentin，VIM），转化因子SNAI2 的基因表达。结果显示TGF-β1 诱导的EMT 模型组α-SMA、VIM 及SNAI2 基因表达显著上调，给予白藜芦醇处理后可显著下调α-SMA、VIM、SNAI2 基因表达。

　　蛋白水平检测结果同样显示白藜芦醇处理可上调TGF-β1 抑制的上皮细胞标志物E- 钙黏蛋白（E-cadherin）蛋白表达水平，下调间质细胞标志物α-SMA 蛋白表达水平。

　　4. EMT过程中白藜芦醇对TGF-β1信号通路的影响

　　蛋白质免疫印迹法（Western blot）结果显示TGF-β1 及白藜芦醇处理对Smad3、JNK、ERK，p38总蛋白表达均无影响。TGF-β1 可显著上调Smad3、JNK、ERK，p38 蛋白磷酸化，而加白藜芦醇处理可降低TGF-β1 上调的Smad3、JNK 及ERK 蛋白磷酸化水平，但对p38 蛋白磷酸化水平无影响。

　　研究发现，白藜芦醇可通过抑制EMT 从而阻止肺纤维化的形成。分子水平检测（实验4）发现，白藜芦醇可显著抑制TGF-β1 诱导的间质细胞标志物及转化因子（包括VIM、SNAI2、a-SMA）的基因表达，上调上皮细胞标志物E-cadherin 蛋白表达水平，下调间质细胞标志物α-SMA 蛋白表达水平，证明了白藜芦醇对EMT的抑制作用，暗示白藜芦醇抑制肺纤维化的可能机制是通过抑制EMT进程来抑制间质细胞的增殖活化，进而阻止肺纤维化的形成。这为找寻抗肺纤维化的治疗药物提供了新思路。