黏菌素或替加环素分别与3种抗菌药物联合对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的体外抗菌效果研究

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种广泛存在的革兰阴性条件致病菌，可引起多种感染性疾病，已成为全球范围内医院感染的重要病原体之一[1-2]。随着抗菌药物在临床的广泛应用，鲍曼不动杆菌的耐药性日益严重，尤其对碳青霉烯类药物的耐药率迅速上升，在部分医院ICU甚至高达94.0%[3-6]。2024年，世界卫生组织将耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CRAB）列为一级“危急”耐药菌，亟需开发新型抗菌药物并制定有效的防控策略以应对其传播与感染。

目前，黏菌素（COL）和替加环素（TGC）被视为治疗CRAB感染的主要药物，但单药治疗存在疗效有限、高剂量使用时毒副作用显著等问题，且单药耐药菌株的不断出现进一步限制了临床抗菌药物的选择[7-8]。研究表明，多药联合治疗不仅可延缓耐药进程，还能延长现有抗菌药物的临床使用周期[9]。部分联合用药方案在体外药敏试验中表现出协同或相加作用，为改善CRAB感染预后提供了更多可能[10-11]。

本研究采用棋盘稀释法，评估以COL和TGC为基础，分别与亚胺培南（IPM）、阿米卡星（AMK）、头孢哌酮-舒巴坦（CSL）联合使用，评估其对临床分离CRAB菌株的体外抗菌效果，并结合部分抑菌浓度指数（FICI）分析药物间的相互作用，旨在筛选具有协同潜力的联合方案，为临床CRAB感染的精准治疗提供循证医学证据。

1 材料与方法

1.1 材料

回顾性收集2023年6—12月南京医科大学附属淮安第一医院临床样本分离的非重复CRAB菌株（患者初次分离株）。

本研究已通过南京医科大学附属淮安第一医院伦理委员会审批（审批号：KY-2024-367-01），并豁免患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 菌种鉴定

采用VITEK基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）对所有菌株进行鲍曼不动杆菌鉴定。

1.2.2 体外抗菌药物敏感性试验

采用VITEK 2 compact全自动微生物鉴定及药敏分析仪（法国 Bio-Merieux）及对应的革兰阴性菌药敏检测卡（AST-N335）进行菌株复核鉴定及最低抑菌浓度（MIC）测定。药敏结果依据美国临床和实验室标准协会（CLSI）M100-S34（2024版）标准[12]进行判读。

对CLSI未提供折点的药物，参照仪器说明书进行判读。其中，TGC的敏感性判读采用美国食品药品监督管理局（FDA）及国家药品监督管理局（NMPA）的推荐标准：MIC≤2 mg/L为敏感，=4 mg/L为中介，≥8 mg/L为耐药。鉴于自动化系统对TGC药敏结果可能存在偏差，本研究依据国内专家共识，对敏感结果予以采纳，对中介或耐药结果采用浓度梯度扩散法（Etest法）进行复核验证[13]。

1.2.3 棋盘稀释法体外联合药敏试验

采用微量肉汤棋盘稀释法进行体外联合药敏试验。自行设计联合药敏板版型，以COL和TGC为基础药物，分别与IPM、AMK和CSL进行联合。药物浓度范围分别为TGC（0.03～32 mg/L）、COL（0.03～32 mg/L）、IPM（0.06～16 mg/L）、AMK（0.12～32 mg/L）、CSL（0.25～64 mg/L）。所有浓度均覆盖并超出其各自的临床耐药折点，以确保准确计算FICI。

1.2.4 联合效果评估

准确记录两种药物单用时的MIC（记为 MICa单药和MICb单药）以及在联合用药条件下两种药物的MIC（记为 MICa联合和MICb联合）。根据棋盘稀释板中未见细菌生长的最低药物浓度，计算每行列FICI，以评估药物联合效果。若药物的MIC值低于检测范围下限，则以其下限值进行计算；若高于检测范围上限，则以其上限值进行计算。FICI的计算公式：FICI=(MICa联合/MICa单药)+(MICb联合/MICb单药)，取FICI最小值所对应的药物浓度作为联合MIC值。联合效果评估标准：FICI≤0.5为协同作用，0.5＜FICI≤1为相加作用，1＜FICI≤2为无关作用，FICI＞2为拮抗作用[14]。

1.3 统计学处理

采用 Excel和SPSS 27.0 软件进行统计学分析。分类变量以频数或百分数表示，组间比较采用χ2检验或 Fisher 精确概率法。双侧检验， 以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1菌株耐药情况

经MALDI-TOF MS鉴定，本院连续分离的48株CRAB菌株均为鲍曼不动杆菌菌株，置信度均为99.9%，即鉴定种水平可信。药敏试验结果显示，所有菌株对常用抗菌药物呈现高水平耐药，未发现对COL耐药的菌株（表1）。

表1 48株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的药物敏感性分析

2.2黏菌素和替加环素的单药MIC分布

48株CRAB菌株均对COL敏感，对TGC的耐药率为29.2%（14/48），该药敏结果与表1中的单药药敏结果基本一致（图1）。

图1 黏菌素(A)和替加环素(B)的单药MIC分布

MIC：同表1；绿色、黄色、红色分别代表敏感、中介、耐药

2.3 6种联合用药方案的体外抗菌效果

6种联合用药方案对48株CRAB菌株的MIC值（MIC范围、MIC50、MIC90）均较单用时降低（表2）。

表2 6种联合用药方案对48株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的体外抗菌效果

联合效应评价显示，以COL为基础的联合方案均表现出良好的协同或相加作用，其中COL+IPM组的协同作用率最高（83.3%），COL+AMK组和COL+CSL组主要表现为相加作用（相加作用率分别为66.7%和70.8%）；以TGC为基础的联合方案则主要表现为相加或无关作用，其中TGC+CSL组的相加作用率最高（75.0%），TGC+AMK组的无关作用率最高（70.8%）；6种联合方案均未观察到拮抗作用（表3）。

表3 6种联合用药方案对48株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的抗菌效果评价［n（%）］

进一步分析表明，COL+IPM组与其他联合方案的抗菌效果存在显著差异（χ2=110.064，P＜0.001），其协同作用率显著高于其他5种联合方案的整体水平（83.3%比12.5%, P＜0.001）以及以COL为基础的其他方案（83.3%比31.3%, P＜ 0.001），相加作用率显著低于其他5种联合方案组（16.7%比58.7%，P＜ 0.001）和以COL为基础的其他方案（16.7%比68.7%，P＜0.001)；此外，在所有以COL为基础的联合方案中均未发现无关作用（表4）。

表4 COL+IPM组与非COL+IPM组的抗菌效果比较［n(%)］

48株CRAB菌株对6种药物组合的单药MIC、联合MIC及相应的FICI值详见附表1。

3 讨论

CRAB的耐药机制复杂多样，现有研究将其核心机制归纳为以下六类：

①碳青霉烯酶的产生；

②外排系统活性上调；

③膜通道蛋白表达减少或功能缺失；

④药物靶点结构变异；

⑤生物膜形成；

⑥可移动遗传元件介导的耐药基因水平转移[6,15-17]。

本研究发现，纳入研究的48株CRAB菌株整体耐药情况严重，对头孢他啶、β-内酰胺酶抑制剂复合制剂及氨基糖苷类药物的耐药率均＞80%，仅对米诺环素和TGC的耐药率较低（分别为6.3%和27.1%）。

作为治疗CRAB感染的重要药物之一，COL因其肾毒性及神经毒性等不良反应，在临床单药应用中受限[18]。然而，当COL与其他药物联合使用时，不仅可减少单药剂量，降低其毒性作用，还可通过协同或相加作用增强对COL异质性耐药鲍曼不动杆菌的抗菌活性[19]。目前，联合用药方案在疗效稳定性和耐药控制方面均优于单药。2024年美国感染病学会（IDSA）指南建议多黏菌素B或高剂量TGC与至少1种其他药物联合用于治疗中重度CRAB感染[20-21]。

本研究发现，以COL为基础的联合用药方案均表现出良好的协同或相加作用，这与多项体外联合药敏研究结果一致。国外研究报道，COL分别与CSL或碳青霉烯类药物联用，在体外及临床应用中均显示出显著的协同效应[22-23]。苏爱美等[24]亦发现，COL与CSL的协同作用率达92.0%，与IPM联合的协同作用率为64.0%。本研究显示，COL+IPM组的协同作用率最高（83.3%），且二者联用后MIC50和MIC90均显著降低，其协同效果优于其他组合，提示该联合方案尤其适用于本地区及具有相似耐药谱地区的CRAB感染治疗。其机制可能与COL作为脂肽类抗菌药物，可破坏细菌外膜脂多糖结构、增强其他抗菌药物渗透性有关[11,20,25]，使原本难以进入菌体的药物更易到达作用靶点。此外，菌株的地域差异性也可能是导致联合效果不一致的原因之一[24,26]。

TGC作为米诺环素的衍生物，除可逆性结合30S核糖体亚基、抑制细菌蛋白质合成外，还能够有效规避四环素类药物的耐药机制（如外排泵及核糖体保护蛋白作用）[27]。既往研究表明，在对TGC敏感的CRAB菌株中，其与AMK联用的协同作用率可达47.7%[28]。胡永煜等[29]研究发现，TGC与CSL联用对CRAB的相加作用率高于协同作用率（49.0%比4.0%）。然而在本研究中，以TGC为基础的联合用药方案未观察到协同效应，多表现为相加作用（相加作用率为29.2%~75.0%）。分析原因可能与本研究纳入的CRAB菌株对TGC的基线MIC水平较高有关（MIC50和MIC90分别为2 mg/L和8 mg/L），较高的初始MIC值一定程度上限制了TGC与其他抗菌药物产生更强协同效应的潜力。

本研究仍存在以下局限性：（1）实验仅检测了体外药物联用表型，其结果不能完全等同于临床实际疗效；（2）当前评估的药物组合限于临床最常用抗菌药物类别，未能涵盖新型抗菌药物。未来研究应着重开展前瞻性临床试验，通过动物模型或临床病例对照研究验证COL与TGC联合方案在体内的有效性；同时，应进一步探索含新型抗菌药物或新靶点抑制剂的联合方案（如舒巴坦-度洛巴坦+COL、依拉环素+IPM、依拉环素+COL等）对CRAB的抗菌效果，并深入解析COL与IPM协同作用的具体分子机制。

（本文编辑：李慧文）