[科普中国]-进化酶

简介

自然界所有复杂的生物都是通过自然进化而来的，并相对独立地存在。酶则是生命活动按照预定方向进行的根本保证。科学家们在不断发现自然界中新酶的同时，试图对天然酶分子进行改造。近年来，随着基因工程技术的快速发展，易错PCR、DNA shuffling等突变技术的应用，建立了改造天然酶分子和构建新酶的有效方法——酶分子体外定向进化技术(directed evolution of enzyme in vitro)。在实验室条件下模拟自然界几十亿年的漫长进化过程，让目标酶分子在事先设计的道路上快速“进化”，从而产生具备多种有益特性的酶分子。这种采用酶分子定向进化技术，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择所需性质的突变体制备的酶称为进化酶。

酶分子定向进化原理酶分子的定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或人为获得的)出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。通常采用PCR技术扩增待进化的酶基因，利用Taq DNA聚合酶没有3’—5‘校对功能的特性，控制扩增条件，使产物中引入随机突变，从而获得突变基因库。然后通过定向选择法，筛选出所需性质优化的酶。简言之，定向进化=随机突变+定向选择。定向选择是关键，策略和方法灵活多样，根据目的制定。定向进化的基本策略与自然进化十分相似。不同之处在于自然进化是环境作用引发突变，其进化历程十分漫长；而定向进化完全是人为引发突变，人为控制酶分子朝着人们期望的特定目标进化。定向进化历程可大为缩短(数年、数月甚至数天)。

定向进化策略易错PCR易错PCR是利用低保真度Taq DNA聚合酶或改变PCR反应条件(包括提高镁离子浓度、加入锰离子、改变dNTP浓度等)，增加Taq DNA聚合酶突变频率，引入碱基错配，导致目的基因随机突变。经多轮PCR扩增，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。如枯草杆菌蛋白酶E在非水相溶液中经第一次定向进化后，得到的突变体PC3在60%和85%的二甲基甲酰胺(DMF)中的催化效率Kcal/Km分别为天然酶的256倍和131倍，比活性提高157倍。再经两次定向进化后的突变体催化效率比PC3高3倍(60%DMF)，比天然酶高471倍。

DNA改组DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR(sexual PCR)，是对一组相关基因用DNaseⅠ或超声波进行切割产生随机大小的DNA片段，各片段互为模板和引物再进行PCR扩增，直至产生全长的基因。例如头孢菌素酶的定向进化是将来自4个不同菌种的头孢菌素酶基因视为一个基因库，单独进化的4个基因中每个酶基因对拉氧头孢抗生素的抗性均提高了8倍左右，而4个基因在一个体系中同时参与改组后，抗性提高了270倍～540倍。进化速率提高了约50倍。最佳突变体含有4个基因中3个基因的8个基因片段，33个突变位点。DNA改组在理论和实践上都优于连续易错PCR技术。它不仅可以加速有益突变的积累，而且能使酶的多个优化特性聚为一体。

外显子的改组由于真核基因的编码序列通常被内含子间隔分开，转录后需要加工剪切内含子、连接外显子。自然界中，不同的内含子间发生同源重组导致不同外显子的结合，并组装成编码新蛋白的基因，这一过程称为外显子改组(exon shuffling)。DNA改组和外显子改组的相同点是都在各自含突变的片段间进行交换；不同之处是外显子改组是靠同种分子间内含子的同源性带动，即是通过内含子介导外显子重组，而DNA改组发生在整个基因片段上，不受任何限制。Kolkman等于2001年建立了以外显子为单元进行自由重组的外显子改组技术，它可以加入更多的理性设计，甚至可以完全避免点突变，因此可应用于医药等某些特殊领域1。

定向进化的应用定向进化技术现已广泛用于酶分子的改造，在提高酶分子的催化活力、酶分子的稳定性以及对环境的适应能力等方面取得了显著成效。如Joo等从假单孢菌细胞色素P450的定向进化得到的突变体，在无辅助因子存在下，通过“过氧化物途径”方法可羟基化萘，比天然酶的活性提高20倍。Zhao等利用连续易错PCR技术结合交错延伸方法重组DNA，并采用连续提高培养温度对突变体进行筛选，最终获得了一株突变体，不仅将枯草杆菌蛋白酶的最适温度提高了17℃，还使酶在65℃的半衰期增加了200倍。吉林大学酶工程实验室采用易错PCR技术对L一天冬氨酸酶进行了改造，经4轮易错PCR(每轮筛选约3 000个菌落)，最终得到了一株酶活力提高28倍的突变体。研究表明进化酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶，因此更适合于工业化生产L一天冬氨酸。运用合理设计与定向进化结合的方法，Fersht等人将α/β桶状蛋白支架进行氨基酸替换，使吲哚一3一甘油磷酸合成酶(IGPS)活性转变成磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的活性。运用定向进化技术还可以提高或改变酶的对映体选择性。最近研究表明：立体选择性酶的专一性是可以改变的，也就是酶具有柔性。Reetz等的研究表明，来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物P一硝基一苯基一2一甲基癸酸盐的S构型的选择性只有2%，但经过4轮易错PCR突变和筛选之后，它对底物的S构型的选择性达到81%。

酶分子体外定向进化的突出优点是，不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，就可以进行实验设计(非理性设计)；而化学修饰、定位诱变等，需要对酶的氨基酸序列、空间结构等资料有充分了解，才能设计修饰方案(理性设计)。另一方面，该技术简便快速、耗资低且有实效。完全在试管中进行的酶的定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年、几个月甚至更短的时间，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃。极大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围。值得注意的是，定向分子进化也称定向生物技术，并不限于蛋白质类酶，(脱氧)核酶、抗体酶、代谢途径和细胞等的实验室进化研究，在近年来都呈现强劲的发展势头，将使进化论发展成为一门应用科学2。