最近,美国科学促进会发布了一段非常活跃的精液视频,视频中的精液竟然来自于五十年前!更令人称奇的是,科学家用这份精液,成功培育出了30多只小羊。这让人们惊叹的同时,也看到了这项技术可能存在的应用潜力。视频:冻存50年的绵羊精子,依然充满活力;来源: University of Sydney精液来自哪里?生活在五十年前的四只澳大利亚雄性美利奴羊,是这些精液的捐献者,它们的主人是沃克家族的西尔斯。西尔斯是一个经验丰富并且注重科学育种的牧民,他们家族在雅斯平原的“伍拉鲁”管理着8000只羊,并与悉尼大学动物育种项目保持着密切关系。1968年,悉尼大学动物科学研究院的史蒂文.萨拉蒙(Steven Salamon)博士冷冻了这些羊的精液。沃克家族还为精液提供者的其中一只名为“弗雷迪爵士”(Sir Freddie)的公羊拍摄了照片作为留念。古今冻存精液对比:活力不相上下主导本次研究的悉尼大学博士后杰西卡.瑞卡德(Jessica Rickard)首先对保存了五十年的精液做了活力测试,以确定该精液是否适合人工授精。随后,她和同事一起进行了精子质量的体外测试,测试内容包括已冻存50年精子的活力、运动速度和DNA完整性等。一系列测试结束后,他们使用五十年前冻存的精液为56只母羊进行人工授精,其中34只成功受孕并诞下幼崽。同时,他们也将近期冷冻的种羊精液用于人工受精精,结果发现用于受精的1048只种羊中,有618只成功受孕并诞下幼崽。这样,50年前的雄性精子的怀孕率为61%,而最近冷冻精子的怀孕率为59%。它们的受精能力竟然不相上下!“我们发现冷冻50年的精子与冷冻一年的精子活力差别不大。”瑞卡德博士带领的研究团队也惊讶于她们的研究结果。精液是如何冻存的?其实早在200年前,哺乳动物的精子冷冻技术就出现了。1776年意大利生物学家拉扎罗.斯帕兰扎尼(Lazaro Spallanzani)曾经尝试将精子储存在雪中,以低温方式保存精子。但这种冻存方式存在很大的问题:低温时细胞内会产生冰晶,而锋利的冰晶就像在细胞内插入一把利剑,使得细胞内产生内源性机械损伤,引起细胞内环境渗透压、PH、电解质等的改变,造成细胞致命性损伤而死亡。直到二十世纪中叶,英国生物学家克里斯托弗.波奇(Christopher Polge)等人在冻存种牛的精子时加入了甘油,为精液冻存带来了新突破。甘油不仅可以提高细胞膜对水的通透性,还能使冰点降低,延缓冻结对精子细胞的损伤作用。另外,缓慢冷冻过程也可使细胞内的水分渗出至细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而降低由于冰晶形成造成的细胞损伤。与甘油类似的物质还有二甲亚砜。
不同降温速率下细胞的冷冻及冰晶生成:速度过慢时,水分大量流失,细胞皱缩失去活力(上);速度适中时,细胞形态得以维持,且冰晶未进入细胞(中);速度过快时,冰晶在细胞内生成,损坏细胞结构(下)找到了适合于精液冻存的冻存液后,精液冻存就简单多了。首先在精子细胞中加入配制好的细胞冻存液,随后便开始冻存过程。依据不同温度冰晶形成的速率不同,降温过程也有一定的标准:标准冷冻速度开始为-1~-2℃/min,当温度低于-30℃时可加速,到-80℃之后可直接存入液氮中保存(-196℃)。复苏冷冻精子时主要是要快速融化,这样能使胞外冰晶迅速融化,防止水分渗入胞内再次形成冰晶而损伤细胞。精液冻存过程,主要分为以下的步骤:
精液冷冻50年后,为何还能孕育生命?精液与冻存液混合在一起,并在降温速度得到控制的情况下被冻存起来,细胞膜和胞内结构完整性得到了保护。此外,存储在液氮(-196℃)条件下,细胞处于非耗能状态,几乎所有的生命活动都被抑制了。在这种状态下,其原本的遗传物质和细胞形态都保持原样,在解冻后,精液中的精子就和冻存前的精子差异不大了。新生命的诞生,从精卵结合开始。研究人员将复苏的精液人工注射受孕母羊的输卵管中,经母羊正常怀孕妊娠后,就诞生了羊父亲精液在冷冻50年之后的小美利奴羊。
研究人员(左)和冷冻精液复苏融解后,人工受精后得到的美利奴羊(右);图片:Morgan Hancock/University of Sydney精液能保存得更久吗?自二十世纪中叶,精子冷冻技术在近70年内发展迅速,出现了很多优势各异的精液冷冻技术:
精子冷冻技术目前在很多方面都有应用,比如对于某些肿瘤患者,因需要进行相关放疗、化疗或手术治疗,可能影响到精子的活性与功能,就可以采取精子冷冻的方式,为以后的体外受精提供了可能。另外,精子冷冻技术在畜牧业方面也可以有很好的应用,比如构建不同物种的精子库,使得动物品系的异地合作与交流、挽救濒危动物等方面变得更加方便与现实。“此次羊精液冷冻50年后,成功获得后代的报道,是成功精子冷冻的最长记录。——当然,不同物种的冷冻保存复苏效果会有差异的。目前关于人精子成功冻存报道的最长纪录为30年左右。这些例子都说明,精子长期冷冻后,是可以保留其活性与功能的。”赛业生物的高级科学家,曾任职于耶鲁大学医学院和纽约大学医学院、美国基因打靶公司(iTL)和美国应用干细胞(ASC)生物技术公司等机构的俞晓峰博士说。他没有参与这项研究。俞晓峰认为,从理论上推测,冻存精子保存在-196℃液氮中,可以存放5万年,而不改变其细胞成份。但现实情况是,在冷冻复苏操作过程中,冻存的精子细胞难免受到损伤,从而降低其活性。一般认为,冻存精子复苏后,其活性也只是新鲜精子活性的约50~60%。因此,如何防止与避免精子冻存与复苏过程对精子细胞的损伤破坏,提高精子冷冻技术及人工受精效率等方面,是当前该研究领域的关注点。比如,围绕着不同物种精子细胞特性,提高现有精子冻存液与稀释液的保护效果,筛选最佳冷冻降温及复苏融解速率,以及人工受精最佳条件等。例如,有研究发现,冻存马精液的复苏融解速率与稀释比例,而不是冷冻降温速率因素,对提高冷冻马精液复苏后,人工受精的效率,发挥了更加关键作用。“随着今后精子冻存技术研究的不断深入,优化与完善冷冻精子复苏人工受精的效率,打破目前的冷冻精子50年活性纪录是完全可能的。”俞晓峰说道。作者 | 王钰 厦门大学 博士研究生审稿 | 俞晓峰 赛业生物技术公司高级科学家责编 | 高佩雯文章由腾讯科普“科普中国头条创作与推送项目”团队推出转载请注明来自科普中国