[科普中国]-联合风险评估

农药混合使用背景

随着近年来农药品种、产量及使用量剧增，农业生产过程中混用及施用多种农药的现象较为普遍，国内外在食品安全风险监测结果中发现同一农产品含有多种农药残留的现象比较突出。2007年，欧盟食品农药残留风险监测结果显示，有近26%的食品中含有多种农药残留，其中含3种以上的占总样品数的6.3%，单个产品中最多含有8种农药。从笔者等2013年对浙江省草莓的检测情况看，同一样品甚至含有10种农药残留，含3种以上农药残留的比率超过总样品数的20%(未报道)。目前我国在制定农药残留限量时一般仅考虑单一农药的风险，在各类监测项目中对不合格产品的判定也是以某一种农药是否超标作为标准，尚未考虑多种农药同时残留的情况。研究表明，与暴露于一种农药残留相比，人体同时或者先后暴露于多种农药残留可能引起更高或者更低的联合效应。因此，传统的仅针对单一农药品种进行评估的方式可能会造成对风险程度的低估或者高估。美国在1996年的《食品质量保护法》中已要求其环保局(EPA)在制定农药残留限量时须考虑来源于不同暴露途径的多种农药的联合效应。欧盟396/2005号法规也规定了在制定农药残留限量时必须考虑农药的累积性风险(欧盟和美国评估机构称联合暴露风险评估为“累积性风险评估”)。近年来，农药联合暴露受到了越来越多的关注。美国环保局连续出版了多部混合物风险评估报告与指南，完成了5组机理相同的农药的联合暴露的风险评估。2007年，世界卫生组织国际化学品安全规划署(WHO/IPCS)为混合化合物的风险评估制定了通用框架，并推荐了分阶段推进评估法(tiered risk assessment)。欧盟食品安全局(EFSA)专门成立了累积性风险评估工作组，其植物保护产品和残留科学委员会(PPR)提出了多种农药联合暴露的累积性风险评估方法，并制定了机理相同或相似农药的累积性评估组(cumulative assessment group，CAG)分组标准，为农药的联合暴露风险评估提供了大量的基础数据。2012年，该组织又进一步推荐了不同作用方式农药的联合暴露风险评估方法。此外，荷兰健康委员会(Heath Council of The Netherlands)、挪威食品安全委员会(Norwegian Scientific Committee for Food Safety，VKM)也相继开展了农药残留联合暴露风险评估研究，并各自出版了相应的指南报告。

虽然我国农药残留风险评估工作起步较晚，但有关农药联合暴露风险评估的探索已取得一定进展。陈晨等采用相对毒效因子法(relative potency factor，RPF)对中国大米中的有机磷类农药残留风险进行了评估，并对多种农药在多种环境生物中的联合毒性进行了探索;袁玉伟等采用概率性评估方法研究了浙江地区蔬菜中毒死蜱和氯氰菊酯联合暴露的膳食风险;李耘等对混合化合物风险评估中不同情境下的建模技术进行了综述。本文针对我国农产品中的农药多残留现状，综合目前国外常用的联合暴露评估方法，以杨梅中农药残留暴露评估为例，重点介绍了具有相同作用机理农药的联合暴露评估分组方法和常用评估方法，阐述并分析了各方法的应用范围、数据要求及优缺点，以期为促进我国农产品中农药多残留的联合暴露风险评估研究提供参考。

联合暴露( combined exposure ) 的定义不同国家对多种化合物联合暴露的定义不同。美国环保局采用“累积性暴露(cumulative risk assessment)”概念，即“多种物质多个途径的暴露(combined exposure to multiple chemicals including all routes)”，其暴露途径包括饮用水、食品以及环境。欧盟在396/2005号法规中也采用了“累积性暴露”的说法，但是其范围与美国环保局定义的范围不同，欧盟的“累积性暴露”指“食品中多种化合物的联合暴露(combined exposure in food)”，即仅仅只考虑通过膳食摄入的暴露，不涉及其他途径的暴露。世界卫生组织国际化学品安全规划署建议采用“多种化合物的联合暴露(combined exposure to multiple chemicals)”替代“累积性暴露”。该组织认为，联合暴露风险评估应包含两种暴露情景，即“多种化合物多种途径的联合暴露(combined exposure to multiple chemicals by multiple routes)”和“多种化合物单一途径的暴露(combined exposure to multiple chemicals by a single route)”，在讨论食品中化合物暴露风险时，应采用“多种化合物的联合暴露”这一概念。

相比较可见，上述关于联合暴露的定义中，世界卫生组织国际化学品安全规划署的定义最为简洁和清晰，可以避免因不同机构定义的范围不同而造成的混淆。因此，本文拟采用该组织推荐的“联合暴露”概念来描述多种农药在农产品/食品中残留的联合暴露风险。

联合暴露研究现状联合作用的类型农药残留联合暴露风险评估毒性效应评价的关键取决于联合作用的类型。自1939年Bliss首次提出化合物联合作用(combined effect)的概念后，Finney、Hewlett等及Ashford等先后对混合物的联合作用进行了探索。目前普遍认为食品中农药残留的联合作用形式主要有3种：浓度相加(concentration addition，CA)、独立作用(independent action，IA)和相互作用(interaction)。

浓度相加也被称为剂量相加(dose addition，DA)，是指当几种农药在化合物结构上为同系物或其毒性作用靶器官相同、毒性作用机制相似时，机体暴露于多种农药中所产生的总效应等于各种农药单独效应之和，即农药毒性呈相加作用。独立作用也被称为效应相加(response addition，RA)，是指不同农药由于毒性作用的受体、部位、靶器官等不同，因此所引起的生物学效应互不干扰，同时或者先后暴露于两种或者两种以上这样的农药时对机体的影响表现为每种农药各自的毒性。相互作用则是指两种或者两种以上化合物的联合毒性效应不同于剂量相加和效应相加，而是产生了协同作用或者拮抗作用的情况，其作用程度与化合物的剂量水平、暴露途径、暴露时间和持续时间以及生物靶标有关。

联合毒性效应研究进展目前，关于与人类和哺乳动物毒理学相关的混合物联合毒性效应的研究报道较少，相关研究主要集中在生态毒理学方面，并主要侧重于二元混合污染，以农药对细菌、藻类及大型溞等生物的毒性测定为主，也有利用鱼类或陆生无脊椎动物蚯蚓、线虫等进行农药毒性研究的报道。多项研究认为，作用机制相似的农药的联合毒性可通过浓度相加方法进行准确预测，只有极少数毒性作用不同的混合农药更适合采用独立作用的方式进行评估。Altenburger等研究了海藻中二元混合物的慢性毒性，通过137种农药的两两混合试验，证明了其毒性效应具有浓度相加的特征;Faust等采用38种杀虫剂和杀菌剂，两两混合进行试验，发现66%的混合物的联合毒性符合浓度相加方法预测结果。Deneer在综述中重新评估了202个农药混合物的试验结果，认为在高于90%的情况下，通过浓度相加方法均可准确评估混合物的联合毒性，偏差不超过2倍，尤其是对于85%的重新评估的化合物，虽然其作用机理不同，但通过浓度相加方法仍可准确评估其联合毒性。Belden等在2007年发表的大样本研究结果为这些早期的发现提供了依据，他们将207个采用浓度相加方法评估得到的农药混合物联合毒性结果和37个采用独立作用方法得到的评估结果，通过模型偏差率(MDR)表征了预测与实测的混合物毒性比率。结果发现：浓度相加方法的MDR中值为1，5%试验的MDR值大于2，另外有5%试验的MDR值小于0.5，表明该方法的平均预测能力较高1。Belden等指出，浓度相加是一种略为保守的方法，可广泛应用，但可能由于存在相互作用而低估真实的效应。

独立作用法计算联合毒性的理论基础是统计学上独立事件发生的概率。该方法利用混合物中各组分的单一效应来评价联合毒性，认为单一物质在低于其效应水平时，将不会对联合效应产生贡献，若所有的组分都低于效应水平，则联合效应为零。基于此假设，欧盟食品安全局植物保护产品和残留科学委员会认为食品中的农药残留水平一般不会超过其毒性阈值，基本不会发生联合作用。因此，该委员会在针对食品中的农药多残留进行联合暴露评估时一般不考虑独立作用的情况2。

相互作用一般有3种形式：化合物之间的直接反应、毒物动力学反应和毒效动力学反应。目前对于相互作用的认识都是来源于较高浓度的暴露，这些暴露量远远超过了食品中的实际暴露量。然而，高暴露量下所产生的反应并不意味着能与低暴露量时的反应相关。多个研究机构曾讨论过食品中的暴露情况，英国毒理委员会、欧盟食品安全局植物保护产品和残留科学委员会以及欧盟非食品委员会认为:尽管不能排除食品中的多种农药残留会发生相互毒性作用，但至今尚无充分的实验证据证明农药在食品中的残留水平能够发生相互作用。 在生态毒理学领域，就应用浓度相加法和独立作用法分别得到的联合毒性效应预测结果进行系统对比分析后证明:浓度相加法评估的结果更为保守，但总体来讲，两种评估方法所得结论在数值上差异并不大。目前一般将浓度相加法作为混合物毒性风险评估的默认方法。其原因主要是基于两点:第一，浓度相加法评估中对数据的要求没有独立作用法严格，浓度相加法适合评估有效的暴露量，而独立作用法则需要绘制全面的暴露量-反应曲线，尤其当暴露量很低时。第二，前瞻性的混合物毒性效应评估应遵从预防为主的原则，而浓度相加法能得出更为保守的估计值，因此在生态毒理学领域得到了广泛的应用。但浓度相加法在人类毒理学中应用的研究还较为滞后，仍基于“浓度相加法是大范围适用的”这一尚存争议的假说基础上，这与世界卫生组织国际化学品安全规划署的观点相符。在设计多组分化合物的联合暴露风险评估框架时，国际化学品安全规划署认为，若无法辨别协同或拮抗作用，则在最低级别的评估中应采用浓度相加法。在目前的联合毒性效应评估中，浓度相加法应用最为成熟和广泛，该方法已被不同的评估机构如欧盟食品安全局植物保护产品和残留科学委员会及美国环保局指定为最基本的缺省方法。

联合风险评估方法食品中农药残留评估分组理论上讲，当化合物的作用机理相同时，即使单个化合物的暴露量低于其无作用剂量，在联合暴露的情况下也可能产生明显的不良效应。美国环保局在1999年就提出:对具有相同分子靶标的化合物，例如作用于乙酰胆碱酯酶的有机磷类农药，可作为一个评估组进行评估，这种评估组被称为共同机制组(common mechanism group，CMG)。以此作为分组依据，美国环保局评估了5组具有共同作用机制的农药：有机磷类、氨基甲酸酯类、三嗪类、氯代乙酰苯胺类和除虫菊酯/拟除虫菊酯类。在此基础上，欧盟食品安全局提出了累积性评估组(CAG)的概念。累积性评估组较共同机制组包含的内容更为广泛，其不仅包含作用机理相似的农药，也包含机理不同但毒性作用相似的农药。欧盟食品安全局认为，除了把具有相同分子靶标的农药归为同一评估组外，作用于相同靶器官的农药也可以归类为同一个评估组。无论是共同机制组还是累积性评估组，都是以浓度相加法为基础对风险进行叠加计算。为进一步推进农药评估组的建立，欧盟食品安全局收集了2009年5月1日之前所有已登记农药的相关毒理学数据，并根据不同农药对不同靶标器官的作用进行了归类。随后，Wolterink等完成了所有已登记农药对神经系统、肝脏和生殖发育系统的不良效应的分组。这些工作给其他国家的相关研究提供了借鉴及基础数据来源。在风险评估方法的选择上一般都以浓度相加法为基础。最常用的几种联合暴露评估方法包括危害指数法(hazard index，HI)、相对毒效因子法(relative potency factor，RPF)、暴露阈值法(margin of exposure，MOE)及分离点指数法(point of departure index，PODI)3。

危害指数法( HI)危害指数法适用于毒性相似且具备明确剂量-反应关系的一组化合物，其单个化合物的关键效应可通过剂量-反应关系确定，再通过不确定因子外推得到安全参考剂量。一般是将无作用剂量(no adverse effect level，NOAEL)外推100倍，获得其安全参考剂量:每日允许摄入量(acceptable daily intake，ADI)和急性参考剂量(acute reference dose，ARfD)，其中ADI用于描述慢性毒性，ARfD用于描述急性毒性。单个化合物的暴露量与其安全参考剂量的比值则为该单个化合物的风险，将不同化合物的风险相加即得到联合暴露风险。其计算方法见公式：HI=∑ni=1EiRfDi，式中Ei为单个化合物的暴露量，RfDi是单个化合物的安全参考剂量。虽然“安全参考剂量”在不同国家的具体表现形式不同，但其实际意义相同。美国环保局采用参考剂量(reference dose，RfD);世界卫生组织国际化学品安全规划署采用ADI或者ARfD。但是无论哪种形式，在进行联合暴露风险描述时，都是将不同化合物的暴露量与其安全参考剂量的比值相加，从而得到联合暴露风险指数HI。当HI小于1，表明联合暴露风险可以接受;大于1，则表明存在潜在的健康风险。

该方法使用快速简便，易于理解，适用于以初步筛查为目的的联合暴露评估。但是由于该方法是基于健康参考剂量进行计算的，因此对于超过健康参考剂量的风险无法进行准确的描述。此外，参考剂量的使用也包含了不确定因子，参考剂量未必能够代表不同化合物真实的毒理学意义上的量。

分离点指数法( PODI)分离点指数法中的分离点一般采用无作用剂量或者基准剂量(bench mark dose，BMD)来表示，将每个化合物的暴露量与其分离点的比值相加即得到联合毒性效应。其计算方法见公式：PODI=E1POD1+E2POD2+…+EnPODn=∑ni=1EnPODi，式中POD是每个化合物的分离点，PODI是联合暴露的风险指数，求出PODI后再乘以不确定因子(一般采用100)，若结果小于1，表明其联合暴露风险为可以接受。采用分离点指数法对杨梅中的农药残留数据进行评估，得：PODI=0．0015/1．48+0．00016/0．25+0．00025/0．08=0．0047引入不确定因子100，结果为0.47，小于1，表明该联合暴露风险同样为可以接受。欧盟食品安全局推荐采用分离点指数法代替危害指数法。分离点指法比危害指数法更加透明，不需要在计算过程中引入不确定因子，而是直接采用实验数据，最后再引入不确定因子。在实际应用中，POD的选择一般采用NOAEL数据。但该方法也存在一定的不足。首先，NOAEL数据是根据动物实验或人群流行病学调查结果得到的、未观察到不良健康效应的最大剂量，仅选用了一个点的数据，忽略了整个剂量-反应曲线的斜率。其次，NOAEL值是根据统计学检验与对照组无统计学差异而确定的数值，其与样本大小有关，受实验设计剂量的影响。因此，毒理学界提倡以基准剂量(BMD)代替NOAEL。BMD是指能使某种效应增加到一个特定反应水平时的剂量，其方法是将按剂量梯度设计的动物试验结果，通过适当的模型计算，求得5%阳性效应反应剂量的95%置信区间下限值，即为BMD。采用BMD代替NOAEL有较大的优势，因为BMD参数利用的是毒性测试研究中剂量-反应关系的全部资料，所得结果的可靠性、准确性更好。但基准剂量方法应用的最大局限性是有些化合物不具备相关信息，数据获取非常困难。整体来看，分离点指数法的不足之处是国际上尚无统一的评价方法。目前较为常用的方法是通过乘以一定的不确定因子把PODI转化成“风险杯”(risk cup)单位。如可以采用不确定因子100，则当风险杯数值≤1时，表示该联合暴露风险为可以接受。

相对毒效因子法( RPF)该方法适用于评估同一类别的化合物，要求受试农药具备相同的毒理学终点、相同的暴露途径和持续时间。每种农药的毒性效应通过指数化合物来表示，指数化合物一般选择混合物中较为典型、且研究数据比较充分的化合物。将混合物中各农药乘以其毒效因子，转化成指数化合物的等量物，相加后即得到联合暴露浓度。将联合暴露浓度与指数化合物的参考值进行比较，若联合暴露浓度低于指数化合物的参考值，则认为风险可以接受;反之，则认为该残留水平可能存在风险，需要加强对所评估农药和产品的监管，降低残留浓度。相对毒效因子法已被用于40余种乙酰胆碱酯酶抑制剂类农药的联合暴露风险评估;Caldas等采用该方法对巴西膳食中的25种有机磷和氨基甲酸酯类农药的联合暴露风险进行了评估;Müller等采用该方法评估了4种抗雄性激素类农药的联合暴露风险。美国环保局制定了4组化合物的相对毒效因子(RPFs)：多氯联苯、多环芳烃和有机磷农药，并在其指南中给出了RPF的计算方法：Cm=∑ni=1Ck×RPFk，式中，Cm是以指数化合物表示的混合物浓度;C1为指数化合物的浓度;Ck为化合物k的浓度;RPFk是化合物k相对于指数化合物的毒效因子。

暴露阈值法( M OE)2005年，欧盟食品安全局与世界卫生组织联合举办了关于“多种化合物暴露的联合毒性”国际会议，在会议报告中指出，暴露阈值法最适合用于评估遗传毒性致癌物。暴露阈值(MOE)的计算方法见公式：MOE=PODExposure，式中，MOE为单个化合物的暴露阈值，是参考剂量(POD)与人体暴露量的比值。POD是剂量-反应曲线上的一个剂量值，一般采用BMD10。目前尚未建立采用MOE衡量联合暴露风险的标准。通常认为:单个化合物的MOE高于100，风险为可以接受，MOE数据越大，说明风险指数越低。当计算单个化合物的MOE时，如果数据是从动物试验中获得，通常认为MOE>100时风险是可以接受的，但如果数据是来源于人体试验，则MOE>10为可以接受。对于遗传毒性致癌物，欧盟食品安全局植物保护产品和残留科学委员会认为，如果单个物质的MOE不低于10000，则不会引起健康风险。联合阈值(MOET)是指单个化合物暴露阈值倒数之和的倒数。MOET=∑ni=111/MOEi=1PODI，一般认为，当MOET大于100时，其联合暴露风险为可以接受。