[科普中国]-创伤植物感染法

农杆菌介导法

农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated transformation)属于载体介导法，包括根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导法，是利用农杆菌中农杆菌Ti质粒或Ri质粒做为基因转化载体，将外源基因导入植物细胞，并切割整合到植物染色体上从而完成转化。与其它转化方法相比，农杆菌介导法获得稳定转化体的频率高且重复性好。农杆菌介导法是目前机理最清楚、技术最成熟、使用最多、成功实例最多的转化系统，也是植物基因工程中最重要的一种转化系统。虽然农杆菌对单子叶植物，特别是禾本科植物不敏感，但绝大多数的果树是双子叶植物，对农杆菌比较敏感，因而农杆菌介导法是果树遗传转化的主要方法。木本果树转化成功的例子中，80%以上是采用农杆菌介导法。

农杆菌转化果树的方法有叶盘转化法、体细胞胚或胚性细胞的转化及整体植株接种共感染法等。在1985年，Horsch等发展起了叶盘转化法(leave dish transformation)，之后又广泛用茎段、叶柄、胚轴、子叶等离体材料的进行转化。已先后在苹果、柑桔、猕猴桃、柿、草莓等多种果树上获得转化植株。虽然叶盘法操作简单，适应性广且重复性高，但转化周期长，工作量大。转化时是否采用叶盘法主要决定于外植体的再生能力。作为植物遗传转化操作中的基木受体系统的胚性细胞，由胚性细胞发育而来，其具有很强的接受外源DNA的能力，且获得的转基因植株中嵌合体少，转化效率高，而且体细胞胚具有两极，可同时分化出根和芽。应用体细胞胚作为受体系统进行转化的有核桃、黑核桃、番木瓜等。不过对于大多数林果树来说，成功得诱导出体细胞胚胎比较困难，因而仅局限在少数果树上应用。整体植株接种共感染法一般采用无菌的种子实生苗或试管苗作为外植体，在植株上造成创伤，直接接种农杆菌，或用针头把农杆菌注射到植株体内，使农杆菌在植株体内进行侵染实现转化。虽然这种方法具有较高的转化成功率，但是容易产生嵌合体。应用植株接种共感染法在苹果砧木M26、龙眼、柑桔等果树上取得了成功。

农杆菌转化的载体系统Ti质粒是植物遗传转化的天然载体，它的一个重要性质就是在发生侵染后可以将T-DNA上携带的基因整合到植物的染色体中，并且在染色体上稳定存在，遗传信息可以传递到子代细胞中。

野生型的Ti质粒大约200kb左右，包括T-DNA区（transfer-DNA region)、vir区(virulence region)、con区(region encoding conjugations)、ori区（origin of renlication)。

农杆菌介导植物遗传转化的过程及方法农杆菌转化植物细胞的过程是一个复杂的过程，由细菌和植物细胞发生相互作用，具有真核生物和原核生物转化表达的双重特点。

农杆菌在植物的伤口处附着后，受伤的植物组织被诱导释放一种酚类化合物（如AS等），诱导Ti质粒Vir区基因的表达。Vir区基因表达的产物与T-DNA作用产生T-DNA链，并以DNA-蛋白复合体的形式转移进植物细胞核中。T-DNA转移至宿主细胞核后，在宿主细胞染色体上随机整合，随后起始在植物细胞内的转录和翻译，使外源基因得到表达，改变细胞的表型。

利用农杆菌将外源基因导入植物受体细胞中，目前研究比较多的主要有共培养法、叶盘法和创伤植物感染法1。

共培养法1979年，Marton等首次报道了共培养法的使用。将原生质体与农杆菌进行共培养具有较高的转化效率，但是操作比较复杂，要求的原生质体的质量比较高，因此在许多重要作物中的应用受到了限制。

叶盘法1985年Horsch等建立叶盘法，大大推动了农杆菌介导遗传转化技术的应用。但是在一些难以再生叶片的植物中仍然无法得到很好的转化。

创伤植物感染法用除去致瘤基因的农杆菌直接感染生长植物叶片或嫩芽顶端的伤口，激素诱导枝条分蘖后，检测枝条即可获得转化植株，这种方法叫做创伤植物感染法，也叫整株感染法。整株感染法具有其自己独特的优势，但是目前仅在拟南芥中得到报道（李卫等，1997）。

农杆枪法后来又出现了一种新的转化方法“农杆枪法”（Agrolistic）。表达的Vir区段的基因能在植物细胞内切割保守序列的DNA并转入T-DNA，转化效率约占20%（HansenG，1996）。1999年Ziemienowicz等人利用该方法，有效地将目的基因导入到哺乳动物的细胞核中得到表达。该方法综合了农杆菌转化法和基因枪法的优点，宿主细胞广泛，因而极具发展前途。

近些年来，一些科学家还尝试通过使用抗氧化剂、微创伤处理受体细胞、干燥处理、使用表面活性剂、插入核基质附着序列等辅助方法，来促进农杆菌向一些较难转化植物中的转化。

农杆菌在受体细胞表面的附着是二者相互作用的关键，因此一个合适的接触环境对农杆菌的进入十分重要（Amoah等，2001）。通过超声波和负压辅助处理受体植株形成微创伤，有利于农杆菌进入受体细胞中。但是处理过程中要注意微创口不能太大，会影响转化植株的正常生长；也不能太小，否则将达不到应有的效果。1999年Trick等人建立了超声波辅助农杆菌转化技术（sonication-assisted agrobarterium-mediated transformation，SAAT），首次在农杆菌介导遗传转化过程中应用超声波技术，获得了较好的结果。2008年，毕瑞明在农杆菌侵染切伤的小麦成熟胚时，用注射器进行负压处理，结果也证明小麦成熟胚的转化效率比普通法高（毕瑞明，2008）。

在植物受到逆境胁迫时，植物细胞会产生过氧化物，抑制细胞的正常新陈代谢（DanY等，2009），影响转化植株的再生。因此通过向培养基中添加一些抗氧化剂（如AgNO3、DTT、PVP、GB、GSH等），能去除农杆菌侵染时产生的活性氧，促进转化植株的再生（DanY等，2008）。

表面活性剂可以作为一种渗透剂，使细胞膜变得敏感，也可以通过减小表面张力，促进农杆菌与受体细胞的亲和，提高转化效率。1998年Clough等通过表面活性剂Silwet-77，提高了转化效率。

核机制附着序列（matrix attachment regions，MAR）与T-DNA在植物细胞内稳定、转运和整合有关，因此可以通过在表达载体上插入这样一段序列来促进农杆菌介导的遗传转化。2009年zhang等就从烟草中分离出一个新的MAR，命名为TM2，并通过实验证明了TM2可以提高目的基因在水稻和烟草中的表达水平（zhang等，2009）2。