[科普中国]-Tm值

天然状态的DNA，在比较高的温度下（70-90℃）会发生变性，这时，双螺旋解开为单链，并变成无规则线团。在光学性质上则产生“增色效应”，即紫外吸收（在260毫微米波长处）值升高。这同一般结晶的熔化现象类似。引起DNA发生“熔解”的温定范围比较窄，只有几度。通常以增色效应达到最大值的一半时的温度叫DNA的熔解温度（或熔点），以符号Tm表示。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。1

影响因素（1）G—C的含量：在一定条件下Tm高低由DNA分子中的G-C含量所决定。G-C含量高时，Tm值比较高，反之则低。这是因为G-C之间的氢键较A-T多，解链时需要较多的能量之故。Tm值和G-C的含量可用二一个经验公式表示：

（G—C）%=（Tm-69.3）×2.44

在一定条件下（pH7.0，0.165MNaCl中）Tm值与（GC）%含量呈正比关系。因此，通过测定Tm值，可以推算出DNA分子中的碱基百分组成。

（2）DNA所处的溶液条件：DNA溶液中离子强度低时，Tm较低，而且熔解温度范围较宽；离子强度较高时，Tm较高，熔解温度范围较窄。因此，在表示某一来源DNA的Tm值时，必须指出其测定条件。1

测定测定原理

双链DNA在热变性时吸光度的增高是温度的函数，以相对吸光度为纵坐标，温度为横坐标作图，查得吸光度增加专时的温度，即为了Tm。

材料和试剂

小牛胸腺DNA，溶于0.1XSSC缓冲液中。

仪器

UV—365型紫外—可见—近红外双光束分光光度计，带有SPR—8程序升温仪。

测定步骤

1．以260nm测定DNA的吸光度，按50ug/ml时A=1.00计算DNA的浓度。

2．关于样品的配制，其总容积为3ml，加入DNA的量为60ug左右；吸光度在0.3—0.4之间，再加10XSSC溶液，使待测液的缓冲液最终浓度为1XSSC。

3．以lXSSC为参比溶液，将参比杯和样品杯加盖密封，并在比色杯的两侧涂以硅油，样品杯放入前槽，参比杯放入后槽，将热电耦插入样品盖的金属管内，然后测定。

4．在25℃测定A260、A280、A230、A260/A280应在1。75—1。85之间，A230/A260应在0.5—0.6之间。

5．按下SPR—8程序升温仪的RUN键，分8步自动控制升温，在75℃后，每升高1℃记录一次吸光度值，一直到94℃吸光度不再变化为止。

数据处理与计算

将记录的温度和相应的吸光度整理成表，将各吸光度乘以相应温度的相对膨胀体积（VT/V25），以校正成相当于25℃水溶液体积的吸光度。用校正后的各吸光度除以25℃的吸光度，得出各个温度的相对吸光度。

用各个温度和相对应的相对吸光度绘制DNA热变性曲线，热变性曲线的中点对应的温度为Tm值。

最后将Tm值代入经验公式求出G-Cmol%：

lXSSC G-C=（Tm一69.3）2.44

0.1XSSC G-C=（Tm一53.9）2.44

经过氯化铯梯度离心而分离纯化的小牛胸腺DNA，其Tm为87℃，G-C含量为42%。2

本词条内容贡献者为:

魏大勇 - 副教授 - 西南大学