刷新最小记录！中国开发的基因编辑新工具，有哪些亮点？

科普中国-我是科学家 2021-09-10 作者：莜柒

　　“基因编辑”近年来在生物学领域如雷贯耳，而以CRISPR/Cas为代表的基因编辑系统，正是其中的“当红明星”。就在2020年，CRISPR/Cas领域的开创者埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和詹妮弗·杜德纳，摘得了诺贝尔化学奖桂冠。由于CRISPR/Cas在治疗、检测、育种等应用中表现出了非凡潜力，相关的研究如同雨后春笋般不断涌现。

　　不过，这个系统长期以来也有一些难以攻破的“缺陷”，最突出的一个问题就是传统的Cas蛋白分子尺寸普遍太大，导致包装困难，这就限制了它们在基因治疗方面的使用。所以，开发更小的编辑工具，成为当前这个领域的重要研究方向之一，也是各国竞争激烈的一块“高地”。

　　9月2日，上海科技大学物质科学与技术学院的季泉江课题组，在《自然-化学生物学》（Nature Chemical Biology）上报道了一种全新的基因编辑工具CRISPR-AsCas12f1。这是迄今发现最小的有编辑活性的Cas蛋白，仅422个氨基酸，比传统的Cas9小一半以上。那么这一基因编辑工具有什么特点？与其他已有工具相比有哪些优势？应用前景又如何？对此，我们请课题组负责人季泉江教授来聊聊他的看法。

　　季泉江课题组发表在《自然-化学生物学》的极小CRISPR基因编辑系统论文截图 | Nature

　　CRISPR系统是如何成为今天的主流基因编辑工具的？

　　季泉江：在CRISPR系统发现之前，主要用的是ZFN和TALEN核酸酶系统，它们也能实现一部分基因编辑的功能，但是具体操作起来十分困难，而且效率效果上都非常不理想。2012年CRISPR技术出现之后，ZFN和TALEN很快就被淘汰了。CRISPR系统大致相当于是细菌的“免疫系统”，它是用来对付噬菌体的，包括一串能记录噬菌体信息的DNA序列、一段能当向导的RNA，以及一把能切割噬菌体DNA的“剪刀”——Cas蛋白。噬菌体会感染和杀死细菌，但偶尔有细菌逃过一劫，就有机会通过CRISPR系统把噬菌体的DNA碎片收集起来，做成“档案”放进自己的基因组里。之后如果再有相同的噬菌体来入侵，细菌就可以派Cas蛋白按图索骥去剪断噬菌体的DNA，防止再次“感染”。

　　获得诺奖的两位科学家，就是揭示了Cas9蛋白具体是如何在RNA引导下去切割DNA的，知道了它的机制，我们就可以自己制造“新档案”，让CRISPR系统去切我们设计的目标DNA，实现基因编辑的功能。后来随着CRISPR技术的不断拓展，又衍生出其他很多应用，不仅能切目的基因，还能在细胞里标记特定基因的位置，特异性激活某些基因的转录，还能在不切断DNA的情况下修改基因等等。这样CRISPR就成为目前全世界最流行的基因编辑工具。

　　CRISPR/Cas系统开启了基因编辑的新纪元 | Janet Iwasa for the Innovative Genomics Institute at UC Berkeley

　　近年来不断有更小的Cas蛋白陆续报道出来，这类“极小型”的基因编辑工具有什么特殊的意义？

　　季泉江：有了CRISPR基因编辑技术，就有机会用它去治疗一些以前没有办法治愈的遗传疾病。但是要治疗基因缺陷疾病，不是像平时吃药那么简单把药吃到胃里，而是得想办法把基因编辑工具送到细胞里面，这就需要一个能通往细胞内部的“运输车”来完成这个任务。而目前公认最安全有效的“运输车”是一种腺相关病毒AAV，这种病毒经过人工改造，不带有任何会致病的基因，也不能自我复制，并且可以让它只进入一些特定的器官或组织，所以AAV就成为了非常可靠的运输工具。

　　利用病毒实现向细胞内部“送货”的功能 | NIH

　　但美中不足的是，AAV的容量很有限，最多只能容纳约4700个碱基对的DNA序列。目前主流的基因编辑工具，类似Cas9和Cas12a，它们的编辑效率虽然很高，但是这些基因编辑系统分子尺寸都比较大，仅核酸酶的部分就普遍大于1,000个氨基酸（3000个碱基对），如果再加上引导RNA、启动子等其它元件，就已经超过了单个AAV的装载极限。这就好比我们要搬家，卡车容量是固定的，如果家具体积都很大，一辆车装不下，就只能多花钱再雇一辆。现在很多基因编辑器的递送也采用了这种方法，将编辑器拆成两份分别装在两个AAV中，让它们到达细胞之后再组装起来发挥功能。但如果我们的家具都很小，一辆车就能装完，不仅装下Cas蛋白，还能同时带上一些其他的功能元件，就能节约很多成本，同时提高了效率。这也就是开发小型编辑工具的意义。最近几年，关于小型CRISPR系统的研究报道也逐渐增加，大多都是Doudna团队做的工作。

　　近年来小型CRISPR系统的研究大多由詹妮弗·杜德纳团队完成 | American Academy of Achievement

　　您是如何关注到Cas12f系统的？

　　季泉江：小型CRISPR系统一直是我们研究团队关注的重点，之前我们就报道了一种嗜热链球菌的小型Cas9蛋白（St1Cas9），阐明了它识别和切割靶向DNA链的具体分子机制，论文去年发表在《自然·催化》（Nature Catalysis）杂志上。

　　2020年初的新冠疫情期间，我们注意到一个比较特殊的蛋白，就是Cas12f。这个酶最早是Doudna课题组在2018年报道的，当时只发现它能靶向切割单链DNA，而在体内的测试中没有表现出切割双链DNA的活性。不能在体内切割双链DNA，意味着无法实现更多的编辑功能，所以当时推测这个酶不能成为基因编辑工具。

　　在这之后，立陶宛的一个课题组又重新鉴定了Doudna发现的蛋白，同时还鉴定了一批它的同源蛋白。他们发现，这类蛋白在体外的生化反应中，其实是可以依赖PAM（注：PAM是Cas蛋白识别切割位点的特殊DNA序列）去切割双链DNA的，这就极大激发了我们的研究兴趣。所以，我们当时就想进一步探索一下它到底是否具有基因编辑活性。由于我们课题组之前在细菌基因编辑方面的积累了不少经验，就迅速做了一些测试，结果意外地发现，这个蛋白家族中的AsCas12f1在细菌里的基因编辑效率很高，和Cas9差不多，于是我们开始着手系统地研究这个蛋白。

　　季泉江教授 | 张雅拍摄

　　AsCas12f1有哪些核心特征？

　　季泉江：AsCas12f1来自于一种嗜热细菌（Acidibacillus sulfuroxidans）。这种细菌最早是在美国黄石国家公园的热泉里发现的。

　　AsCas12f1有几个非常独特的地方。首先它识别核酸的方式很特殊，之前的Cas9、Cas12a等都是依靠单个Cas蛋白来识别DNA和引导RNA的。而AsCas12f1则是通过两个相同的蛋白形成不对称的二聚体来识别DNA和引导RNA的，这2个蛋白的氨基酸序列是完全相同的，但它们各自空间结构却不同，通过“二合一”拼成一个新的蛋白复合体。这样的分子机制是非常罕见和新颖的，我们在看到它的同源蛋白结构之后，都不由感叹大自然的鬼斧神工，从某种意义上来说，这也解释了为什么编码这个蛋白所需碱基数比Cas9少一半以上。

　　Cas9是一个完整的“大”蛋白，而Cas12f是两个同源“小”蛋白组合成的蛋白复合体，后者所需碱基数不到前者的一半 | 莜柒绘制

　　其次，AsCas12f1切割DNA的机制也与以往的Cas蛋白差异很大。以往发现的Cas蛋白通常是在DNA靶向序列的内部（是指Cas蛋白要识别的那段DNA序列）进行切割2次，切断DNA的2条链，留下的切口通常是整齐的平末端或者仅有几个碱基的黏性末端。而AsCas12f1的核心切割位点在靶序列之外，分别在靶向链（指与引导RNA结合的那条DNA链）上切1次，在非靶向链上切2次，一共切3次。这样就形成了一组不对称的切口，在靶向链上留下一段较长的DNA“尾巴”。这种不对称的双链切割模式目前是比较罕见的，其它Cas蛋白也有在靶序列外剪切的，但切口通常都是对称的。我们认为这种不对称切割的特征，可用来连接一些经过设计的特殊序列。

　　AsCas12f1切割DNA的机制 | 莜柒绘制

　　另外，由于这种的蛋白来自于嗜热细菌，所以它非常耐热，最适反应温度在45℃到60℃。蛋白性状稳定，不容易降解，这对工业化生产和一些体外应用都非常有利。

　　AsCas12f1系统目前的编辑效果如何？如何解决脱靶等问题？

　　季泉江：我们刚开始是在细菌上进行测试的，主要测试了大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌。它在细菌上的编辑效率与Cas9是不相上下的，最高可以达到100%。我们也在哺乳动物细胞上做了初步的测试，测试的位点里面最高大概在30%左右，目前效率还赶不上Cas9、Cas12a这些常用的Cas蛋白。我们也做过这个蛋白脱靶相关的测试，发现确实有脱靶现象的存在。针对效率和脱靶的问题，我们准备通过分子进化的方法进行改进，这也是目前比较常用的一种方法。

　　利用分子进化可以对CRISPR系统加以改进 | Pixabay

　　做分子进化可以基于蛋白质的结构来进行理性设计，或者利用随机突变找到功能更好的蛋白，这两种方法我们课题组也都在用。比如我们的蛋白结合核酸的能力相比Cas9较弱，那就可以把跟核酸结合区域的氨基酸突变成带正电的氨基酸，这样就能与带负电的核酸有更强的结合力；再比如可以通过引入一些额外的相互作用，改变它对PAM的识别，拓展识别范围。而脱靶主要是由于Cas蛋白有时会切割一些与引导RNA匹配不完美的其他序列，我们就可以通过理性设计优化Cas蛋白和核酸的互作，减少蛋白对不完美匹配的容忍度，来降低脱靶的几率。

　　这项成果有哪些应用前景？

　　季泉江：不论是AsCas12f1蛋白自身，还是用它改造出的一些衍生基因编辑工具，我觉得都可以应用在疾病治疗方面，比如说遗传性疾病、感染性疾病的治疗。另一个就是可以利用Cas12家族蛋白的附加切割活性，将它改造成核酸检测的工具，这种检测工具的精度能够分辨出1个碱基的差异，通常半小时就可以看到检测结果，后期可能提高到更快，在对新冠病毒这样的病原体进行快速检测和分型上很有前景。

　　AsCas12f1系统对病原体的快速检测和分型很有前景 | Pixabay

　　在进行这项研究的过程中遇到了哪些困难？

　　季泉江：总体来说我们在实验的部分还是进展比较顺利的，但是投稿过程中确实遇到了比较郁闷的阶段。我们最先投稿到《科学》，《科学》的编辑还是比较欣赏这个工作的，但最终还是被杂志的顾问委员会拒掉了。之后我们转投到了《自然·生物技术》，《自然·生物技术》的编辑也很认可，并很快送审了我们的文章。一审我们得到了三份相对来说中立且积极的审稿意见，经过了几个月补充实验后再次送审。二审时有两位审稿人已经同意文章发表，但有一位审稿人却变得比较消极和反对，最终编辑还是拒掉了我们的稿件。接下来我们将文章转至《自然》系列的另一个杂志《自然·化学生物学》，《自然·化学生物学》的编辑根据之前的审稿意见，没有再次送审，直接接收了我们的文章。

　　您认为要获得此类创新度比较高的科研成果，有哪些因素至关重要？

　　季泉江：我觉得实验室前期的基础积累是非常关键的，因为要做原创的基因编辑系统开发，就要求有很全面的综合能力，其中包括对微生物学、分子生物学、细胞生物学、结构生物学、生物信息学等领域的知识储备和技术积累；对于这些系统无论在分子层面也还是细胞层面，都要有非常深入的理解，这样整体工作推动起来会比较顺利，如果存在任何某一方面的短板，都可能遇到难以突破的阻碍；另一方面也需要一个良好的实验室氛围，我们团队成员相处比较融洽，并且已经建立起了知识和实验技术的传承体系，让学生在研习期间能尽快学到必要的核心技术。

　　季泉江老师指导学生挑选蛋白质晶体 | 季泉江课题组提供

　　基因编辑相关热点研究竞争激烈，您未来有哪些研究计划，可能面临的挑战是什么？

　　季泉江：竞争确实是一直有的，比如最早立陶宛的研究团队与Doudna团队几乎同时投稿了关于Cas9的关键研究，但因为立陶宛团队的投稿过程非常不顺利，几经辗转，论文发表时已落后于Doudna，最终无缘诺奖。再比如今年年初，东京大学的团队在《分子·细胞》上首先报道了与我们的AsCas12f1同源的Un1Cas12f1的结构，而就在第二天，普渡大学的另一团队将自己做的相似的工作上传到了BioRxiv（预印本平台，供作者先行上传未经同行评议的论文）。前一段时间两个团队几乎同时在BioRxiv上传了Cas12k蛋白结构的相关研究论文，没过几天，第3个团队的相关论文就在《科学》见刊了。

　　我们未来还将继续挖掘和开发更多小型基因编辑系统，开发衍生的基因编辑相关应用，也会尝试一些遗传疾病和感染疾病治疗方面的一些应用。但要进一步推进我们研究的深度和广度，还需要有更多不同学科背景的研究者加入我们的研究团队，或者与我们一起合作来推进研究，这样才能在今天这种激烈的国际竞争中不落人后。